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能够鉴定单蛋白的蛋白质组学工具对于细胞生物学研究和应用至关重要。在这里，我们演示了一种基于纳米孔的单分子肽读取器对单个肽内的单氨基酸取代敏感。DNA旋转酶HEL308将DNA肽结合物拉通过生物纳米孔MSPA。通过纳米孔读取离子电流信号，使单个读数中的单氨基酸取代有能力区分。分子动力学模拟显示这些信号是由尺寸排除和孔结合而导致的。我们还证明了“倒带”肽读取的能力，获得了同一分子的大量独立读数，在单个氨基酸变体鉴定中产生了<10-6的错误率。这些概念验证实验构成了开发单分子蛋白指纹和分析技术的有希望的基础。